Alle Analysen auf Würmer


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An unexpected error occurred. The Ryanodine Receptor Case Study. Click alle Analysen auf Würmer for the english version. For other languages click here. Det alle Analysen auf Würmer tre pattedyr RyR-isoformer med den funksjonelle kanal sammensatt av fire identiske subenheter.

Unormal intra- og inter-subenheten interaksjoner til grunn RyR kanal dysfunksjon og resultere i nevromuskulær og alle Analysen auf Würmer 1.

Identifisering og karakterisering av bestemte domener som er involvert i RyR struktur: Tradisjonelle biokjemiske protein-protein interaksjon teknikker kreve betydelige mengder renset protein, ofte produsert i bakterier.

Dette er Katzen mit Symptomen der Darmwürmer mulig i tilfelle av RyR, en meget stor membran protein sammensatt av ~ aminosyrer, mens dets rekombinante fragmenter er ikke lett mottagelig for bakteriell ekspresjon og rensing.

Således er alternative ekspresjonssystemer som omfatter eukaryote vertsceller som er nødvendig for pattedyr integrerte membranproteiner. Vi har tidligere benyttet Y2H, co-IP alle Analysen auf Würmer tverrbindingsanalyser til kollektivt vise at N-terminale tetramerization er en strukturell funksjon som er konservert over tre pattedyr RyR isoformene 2,3.

Viktigere, har vi funnet ut at et enkelt punkt mutasjon assosiert med arytmogene hjertesykdom forstyrrer N-terminale selv forening og resulterer i en dysfunksjonell RyR kanal 4. I Y2H assay den interactipå mellom to proteiner X og Y er målt ved rekonstituering av et funksjonelt transkripsjonsfaktor GAL4 og den påfølgende aktivering av rapportørgener To forskjellige kloningsvektorer blir brukt til å generere fusjoner av de to testede proteiner med de to fysisk adskillbare, uavhengige domener av GAL4: Denne tilnærmingen muliggjør rask genetisk screening for å påvise protein-protein interaksjoner gjennom parallelltranskripsjonelle aktivering av prototrofe HIS3-kodende for et enzym som er nødvendig for biosyntese histidin og kromogen LacZ som koder for β-galaktosidase β-Gal rapportørgener.

Den største fordelen med den Y2H er at det er en in vivo-analyse som detekterer selv svake eller forbigående protein-protein-interaksjoner. Videre omfatter deteksjon den enkle bruken av vekst seleksjon i media som mangler histidin eller av en kolorimetrisk β-Gal analyse uten behov for rensing av agn og målproteiner eller dannelse av spesifikke antistoffer.

For å alle Analysen auf Würmer Y2H observasjoner, independent biokjemiske teknikker kan benyttes. Co-IP og tverrbindingsanalyser kombinert med immunoblotting er metoder som brukes for å påvise protein foreninger i komplekse prøveblandinger, f. Deres source fordelen er at de rapporterer på protein-protein interaksjoner fra naturlig vev, i motsetning til andre fremgangsmåter som krever bruk av rekombinante proteiner.

Rekombinante proteiner kan også anvendes, typisk uttrykt i en pattedyrcellelinje, hvor de er sannsynlig å ha sin korrekte konformasjon og post-translasjonelle modifikasjoner, så vel som subcellulære lokalisering. Imidlertid, siden ko-IP og tverrbinding er i vitro analyser som gjør bruk alle Analysen auf Würmer homogeniserte celler, er det nødvendig å bekrefte hvorvidt de to proteinpartnere er co-lokalisert i den intakte cellen Vi benytter rutinemessig transfeksjon av pattedyr HEK celler til forbigående å uttrykke pattedyr integral membran og cytosoliske proteiner ved hjelp av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden 2 -4, Som er beskrevet her i detalj.

Dette er en billig måte for effektiv levering av plasmid DNA i celler, men den er avhengig av den spesielle cellelinje som brukes, og cellesammenløpet, samt renhet av plasmid DNA 11, Den ko-IP måling involverer isolering av det naturlige eller rekombinante protein av interesse fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser som muliggjør at ko-rensning av continue reading interaksjonspartnere 10, Den krever bruk av to uavhengige antistoffer, den alle Analysen auf Würmer antistoffet for isolering av protein X, og immunoblotting antistoff for påvisning av proteinpartner Y.

Den kan brukes til å teste hvorvidt et protein interagerer med seg selv ved å generere to forskjellige fusjoner med to forskjellig epitop tags f. Den immunoutfelling antistoffet er bundet gjennom sitt Fc-område på protein-A eller protein-G, avhengig av dyrearten, hvor antistoffet ble hevethvilkener konjugert til agarose eller sepharose harpiks.

Protein X utfelles ved antistoff: Protein-A-harpiks etter inkubasjon med cellelysatet, nemlig den vaskemiddel-oppløselige fraksjon av homogeniserte celler. Co-IP-bør utføres med detergentløselige proteiner for å unngå overdreven ikke-spesifikk binding. Valg av vaskemiddel og dets konsentrasjon, samt antall vaskinger, bør optimaliseres for hver X: Tverrbinding anvendes for å bestemme støkiometrien av den oligomere proteinkomplekset. Den er alle Analysen auf Würmer på en kjemisk reaksjon for å lage kovalente bindinger mellom tilstøtende samvirkende protomere, og derfor, det muliggjør bevaring av proteinets oligomere status ved SDS-PAGE separasjon.

Det er mange kryssbinding reagents av ulike lengder og kjemi er målrettet mot forskjellige reaktive grupper på et proteiner, vanligvis primære aminer, karboksyl eller tiolgrupper. Her beskriver vi bruken av glutaraldehyd OHC CH2 3 CHO alle Analysen auf Würmer, en homo-bi-funksjonelle tverrbindingsmiddel med to aldehydgrupper på hver ende som reagerer med frie aminogrupper som er tilstede i lysinrester 19, Tverrbinding er fulgt i en treringstrinnet eller tidsavhengig måte som resulterer i adduktdannelse.

Vi bør merke seg at kryssbinding induserer ikke oligomeriseringsprosessen men bare skaper stabile broer mellom eksisterende protein komplekser. Viktige hensyn ved gjennomføring av tverrbindingseksperimenter omfatter valget av kryssbindingsmiddel, überprüfen, dass Sie nicht über Würmer konsentrasjon og reaksjonstiden 19, Alle Analysen auf Würmer det Y2H system, agnet: Gjær dyrket i medium som alle Analysen auf Würmer histidin har langsom veksthastighet som avhenger av styrken av agnet: Den β-Gal Analysen utføres i gjær dyrket i medium som mangler bare tryptofan og leucinenten som vokser på fast bærer agar plater eller http://toperlen.de/soriwuxeva/wuermer-praevention-fuer-menschen.php flytende kultur, og de sistnevnte ettergivende http://toperlen.de/soriwuxeva/arten-von-wuermern-fuer-den-menschen.php resultater.

Vi har med hell brukt Y2H å identifisere domene-domene interaksjoner innenfor RyR2 samt nye protein partnere ,12,21, For eksempel, vist vi alle Analysen auf Würmer serie overlappende konstruksjoner som spenner over hele lengden av RyR2 peptidsekvensen for samvirke med et N-terminalt fragment AD4L: Blek blå kolonier ble påvist for BT8: AD4L par som tyder på en sekundær svakere forbindelse med den ekstreme C-terminale domene BT8mens gjæren ko-transformeres med en hvilken som helst annen konstruksjon som forble hvit og derfor negativ for agn: Vi rutinemessig utføre co-IP eksperimenter figur 3 following forbigående ekspresjon i en pattedyrcellelinje HEKsom uavhengig biokjemisk analyse for å forsterke Y2H funnene , Den post-nukleær fraksjon av homogeniserte celler ble solubilisert med vaskemiddelblandingene CHAPS, og det uløselige materiale ble fjernet http://toperlen.de/soriwuxeva/helminth-wuermer.php sentrifugering for å fremstille cellelysatet.

Y2H og co-IP-analyser gitt konsistent bevis for RyR2 N-terminale selv interaksjon, men de gjorde ikke informere på oligomerisering status for N-terminal domene, nemlig om det danner alle Analysen auf Würmer dimer eller høyere komplekser. Det skal bemerkes at kompleksene vil dissosiere og bare de som består av underenheter vil bli detektert ved alle Analysen auf Würmer av SDS-PAGE von Würmern grunn av SDS og varmeindusert proteindenaturering avskaffe protein-protein-interaksjoner.

For å overvinne dette, bruker vi kryssbinding figur 5 som kjemisk og stabilt conjoins pre-eksisterende Proteinkonn oligomerer, hvis molekylvekt kan deretter bli undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE størrelse separasjon I tillegg til monomeren ~ alle Analysen auf Würmeren høy molekylvekt proteinbånd på ~ kDa ble påvist i en tidsavhengig måte, noe som indikerer RyR2 N-terminale tetramer formasjon 3. Spesielt, tetramer var de dominerende oligomere alle Analysen auf Würmer, med minimal dimer og trimer bånd observert.

Denne tilsynelatende molekylmasse er i samsvar med en BT4L tetramer anordnet i enlukket sirkulær måte istedenfor i lineær form, som forventet fra anordningen av de fire underenheter innenfor alle Analysen auf Würmer native RyR2-kanalen. Klikk her for alle Analysen auf Würmer se en større versjon av dette tallet. Etter protein overføring på 80 V for 2 timer på polyvinyyliden difluorid-membran, immunblotting-analyse ble utført ved anvendelse av 1: Pattedyrceller transfektert med plasmid X, er homogenisert og underkastet en reaksjon med glutaraldehyd i tverrbindingsanalysen, alle Analysen auf Würmer av SDS-PAGE og immunoblotting.

Cellehomogenatet, behandles med reduksjonsmidlet ditiotreitol, ble inkubert med glutaraldehyd for å få de angitte tidspunkter. Etter protein overføring på 80 V i 2 timer på polyvinylidendifluorid-membran, ble immunblotting-analyse utført ved anvendelse av 1: Dannelsen av protein homo-oligomerer er en fundamental biologisk prosess som regulerer aktiviteten av transkripsjonsfaktorer, enzymer, ionekanaler og reseptorer 25, Viktigere, har protein oligomeriseringsprosessen også patologiske konsekvenser inkludert nevrodegenerasjon og arytmogene hjertesykdom 4, De metoder som er skissert i denne artikkelen brukes til å identifisere domene-domene interaksjoner formidler protein selv forening og oligomerisering.

Nedenfor peker vi på kritiske trinnene i hver protokoll, og vi diskutere viktige hensyn, begrensninger og feilsøking. Den Alle Analysen auf Würmer Systemet kan benyttes først å screene for potensielle samspill protein partnere på grunn av sin relativt høy gjennomstrømning screening, brukervennlighet og alle Analysen auf Würmer reproduserbare resultater. Y2H prosedyrer alle Analysen auf Würmer utført i et mikrobiologisk laboratorium med standard plate eller shaker inkubatorer og rom containment fasiliteter.

Bruken alle Analysen auf Würmer freshly forberedt kompetente celler trinn 1. Noen stammer som skal bli dyrket i nærvær av 3-amino-1,2,4-triazol, en konkurrerende inhibitor av HIS3-protein, for å slukke enhver konstitutiv ekspresjon av HIS3 reportergen 7,8.

Uttrykk for agn og målet fusjonsproteiner bør verifiseres av immunoblotting Faktisk, er den største ulempen alle Analysen auf Würmer http://toperlen.de/soriwuxeva/mittel-gegen-wuermer-bei-erwachsenen.php Y2H system som agn og target-proteiner er lokalisert i gjær kjernen bort fra deres fysiologiske subcellulære beliggenheten og potensielt mangler spesielle post-translasjonelle modifikasjoner, noe som resulterer i falske positive eller falske negative alle Analysen auf Würmer Pattedyr heterologe ekspresjonssystemer er bedre egnet for studier av pattedyr integrerte membranproteiner alle Analysen auf Würmer form av conformation, post-translasjonelle modifiseringer og subcellulære lokalisering.

En av de mest brukte celle transfeksjonsmetoder er det kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig på grunn av den minimale utstyr og reagenser nødvendig 11, Alternative metoder, nemlig elektroporering, liposomer, kationiske lipider og polymerer, kan gi høyere transfeksjonseffektiviteten avhengig av cellelinjen og konstruere brukt.

I tillegg er inkludering av antibiotika i kulturmediet i løpet av transfeksjon trinn 2. Feller kalsiumfosfat utfelling særlig nøye planlegging og pH-justering alle Analysen auf Würmer 7,05 presist av 2x HBS-oppløsning trinn 2.

Vanligvis protein uttrykk ved forbigående transfeksjon topper innen timer. Når cellene er høstet, alle Analysen auf Würmer nach Pille für Würmer prosedyrer utføres ved alle Analysen auf Würmer ° C for å alle Analysen auf Würmer proteaseaktivitet, og tilsetning av protease-inhibitorer er anbefalt.

Celle homogenisering bør følges av et sentrifugeringstrinn for å fjerne kjerner fordi kromosomalt DNA kan øke løsningens viskositet og øke ikke-spesifikk binding. Således, blir alle Analysen auf Würmer ved hjelp av mekaniske midler i en iso-osmotisk buffer foretrekkes, vanligvis i 0,3 Alle Analysen auf Würmer sukrose eller mM NaCl.

Generelt er sukrose-baserte buffere er kjent for å forbedre alle Analysen auf Würmer og redusere potensiell ikke-nativt protein aggregasjon, men på grunn av phenvisnings hydrering på proteinflaten, er elektrostatisk protein-protein interaksjoner foretrukket.

Omvendt, salt-baserte buffere påvirker nettoladningen av ladede aminosyre-sidegrupper på proteinflaten, og dermed ha en forspenning mot mer hydrofobe interaksjoner baserte Co-IP-er den mest vanlig anvendt biokjemisk analyse for å vurdere protein-protein interaksjoner, spesielt fra opprinnelig vev. Dens viktigste ulempen er kravet for svært spesifikke antistoffer validert for bruk i IP og immunblot 10,16, Dermed er rekombinante proteiner ofte merket med en peptid-epitop, f.

Om ønsket, kan den immunoutfelling antistoffet være kjemisk konjugert på protein-A-harpiks for å unngå alle Analysen auf Würmer eluering og deteksjon i løpet av immunblotting scenen som kan tilsløre det ko-utfelte protein 16; for å oppnå dette, har vi med hell brukt den kjemiske kryssbinder 3,3'-ditiobis sulfosuccinimidylpropionate Det er viktig at et passende vaskemiddel er inkludert i IP-buffer, og det uoppløselige materiale av homogeniserte celler ble fjernet ved sentrifugering for å minimere ikke-spesifikk binding trinn 3.

Valget og konsentrasjonen av alle Analysen auf Würmer er viktige betraktninger: Y proteininteraksjon, mens lavere konsentrasjoner eller mildere detergenter kan tillate en svak interaksjon som skal følges, men kanskje resultere i store ikke-spesifikk binding.

Mellomliggende styrke vaskemidler er foretrukket, for alle Analysen auf Würmer Triton X 0. Antall vaskinger bør optimaliseres for X: Y par testet, typisk tre minutters vaskinger med IP-buffer trinn 3. I alle fall bør en ko-IP-prøven med ikke-immun IgG som immunoutfelling antistoffet alltid bli behandlet parallelt for å tjene som negativ kontroll trinn 3. Den største fordelen med kjemisk tverrbinding er at den informerer om den støkiometriske sammensetning av proteinet homo-oligomer.

Glutaraldehyd er et vanlig kryss-linker fordi det krever ingen spesialutstyr, og det genererer termisk og kjemisk stabile kryssbindinger mellom samspill proteiner 19, Forbindelser med frie aminogrupper bør sløyfes fra analysebuffere trinn 3.


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